摘要：杆状病毒是一类具有双链DNA基因组的包膜昆虫特异性病毒。在众多杆状病毒种类中，加州棉铃虫多核多角体病毒(AcMNPV)是研究最为深入的物种。凭借其生物安全性、宿主范围狭窄以及基因组修饰平台多样化的优势，AcMNPV已成为重要的生物技术工具。本文将系统梳理杆状病毒最广泛的技术应用领域。首先概述其在幼虫和细胞培养中的自然生命周期及其应用价值；其次探讨基于杆状病毒的蛋白质表达系统(BEVS)及其在制药与生物技术领域的多重应用，重点聚焦疫苗生产领域—其中许多疫苗已实现商业化或处于研发后期阶段(如诺瓦瓦克斯公司开发的COVID-19疫苗)。此外，重组杆状病毒(如BacMam)还可作为高效的基因转导载体和脊椎动物细胞蛋白表达系统。最后，美狮贵宾会将详细阐述基于杆状病毒的各种基因治疗策略及其在不同疾病中的应用。本研究的主要目标是提供一份全面的最新综述，涵盖杆状病毒在不同生物技术领域的应用，重点介绍各领域中使用的基因修饰策略。

关键词：杆状病毒；BEVS；BacMam；病毒载体；疫苗；基因治疗

1. 介绍

杆状病毒表达载体系统(BEVS)自上世纪80年代初问世以来，始终保持着重要地位。最初，这类昆虫特异性病原体因其作为生物害虫防治剂的潜力而备受关注，被视为农业领域替代化学杀虫剂的理想选择。随着科学家利用基因改造的加州棉铃虫多核多角体病毒(AcMNPV)和鳞翅目细胞成功生产出重组人干扰素-β[1]，BEVS在生物技术领域确立了其多功能且强大的工具地位。至今已有数千种蛋白质通过该系统实现表达，其中部分产品甚至已投入商业应用。

BEVS技术之所以成为极具吸引力的平台，不仅因其安全性显著优于其他基于哺乳动物细胞培养的病毒载体技术，更得益于其较低的生产成本和最重要的多功能性。正是这种多功能性推动了BEVS技术的指数级发展，也是生物技术公司和研究机构选择它而非传统方案的关键原因。本文将概述BEVS在人类与兽医健康领域的应用，重点解析不同设计方案如何制备免疫原和基因治疗载体(图1)。美狮贵宾会通过PubMed、Scopus、ScienceDirect和GoogleScholar等电子数据库进行了全面文献检索，采用的关键词组合包括：杆状病毒、杆状病毒分子生物学、杆状病毒表达载体、杆状病毒疫苗、杆状病毒等。

类病毒颗粒、杆状病毒展示、杆状病毒与基因治疗、杆状病毒与腺相关病毒、BacMam等。所有文章均根据其科学相关性进行筛。矣畔妊≡窠闲碌某霭嫖铩

图1.基于杆状病毒技术的主要应用示意图。使用BioRender.com软件创建(访问日期：2022年11月29日)。

2.自然界中的杆状病毒

杆状病毒科的成员属于昆虫纲中的鳞翅目、膜翅目、双翅目、直翅目、鞘翅目、脉翅目、夜蛾目和毛翅目[2]等目，专门感染这些目昆虫的幼虫阶段。这类病毒拥有环状双链DNA基因组，长度约80-180千碱基对，被包裹在形似手杖的杆状核衣壳中。该核衣壳直径约40-50纳米，长度200-400纳米，外层包裹着源自宿主细胞的膜结构。

目前，杆状病毒科的分类包括四个属：Alpha baculovirus、Beta baculovirus、Gamma baculovirus和Delta baculovirus。作为杆状病毒家族的重要成员，加州棉铃虫核多角体病毒(AcMNPV)自发现以来便备受关注。尽管其他杆状病毒如家蚕核多角体病毒(BmNPV)及其著名宿主家蚕[3, 4]已展现出生物技术应用价值，但本文重点聚焦于AcMNPV及其在农业领域的具体应用。

核衣壳会根据生命周期的不同阶段，被整合到两种不同类型的病毒颗粒中。当病毒脱离宿主后，它们会被包裹在蛋白质基质中形成特有的包涵体(OBs)，这种结构能有效抵御紫外线辐射、脱水等恶劣环境条件的侵害。杆状病毒的生命周期始于易感昆虫取食含有包涵体的叶片材料时，此时由于pH值变化，蛋白质基质会在昆虫中肠内解体，释放出所谓的包涵体衍生病毒(ODVs)。这些病毒通过膜融合机制感染幼虫肠道上皮细胞，从而启动病毒生命周期。

被感染的细胞会产生第二种病毒粒子，称为出芽病毒(BV)，它会在昆虫幼虫[2, 5]体内传播感染。

基因表达以转录级联的形式进行时间调控，早期阶段的基因产物调控后期阶段的产物生成。

(在早期的即时类中)由宿主RNA聚合酶的作用进行转录，而晚期和极晚期基因则需要病毒编码的聚合酶。

在感染的后期阶段，病毒后代从产生BV转变为将核衣壳保留在细胞核内，并将包膜和包含体包裹到病毒编码的蛋白(多角体)基质中，以形成多个OB(多角体)，这些OB随后在细胞裂解和昆虫幼虫液化后释放到环境中。

杆状病毒自然感染周期的这些固有特性，加上它们狭窄的宿主范围，使它们成为综合虫害管理[6]的重要生物输入工具。

3. 芽生病毒和细胞系

虽然使用杆状病毒作为生物害虫控制剂利用了OBs，但大多数杆状病毒的生物技术应用利用了BV。

BVs是可以在细胞培养中繁殖和使用的形态类型。病毒粒子有包膜，其包膜上有一种III类糖蛋白，称为GP64。GP64负责病毒通过与一种尚未充分表征的细胞受体相互作用而附着并进入宿主细胞。

尽管杆状病毒在致病性和复制能力方面宿主范围极为有限，但芽生病毒却能成功侵入多种细胞类型。就昆虫细胞系而言，源自三叶蛾(Trichoplusiani)和谷螟(Spodoptera frugiperda)卵巢的细胞系应用最为广泛。市售常用细胞系包括Sf9、Sf21以及High Five(BTI-Tn-5B1-4)等。虽然昆虫属于真核生物，但其N-糖基化模式与哺乳动物存在显著差异：昆虫产生的N-聚糖末端仅含甘露糖残基，而哺乳动物则通过多种酶促反应形成末端带有唾液酸残基的复杂N-聚糖。根据蛋白质特性，N-糖基化对其功能可能具有决定性作用。基于这一需求，科学家们开发了多种基因工程细胞系，这些细胞不仅能添加N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖和唾液酸等末端修饰基团，还能阻止[7]型N-聚糖中岩藻糖的添加。同理，SweetBac [8]病毒载体搭载杆状病毒基因组，可提供合成哺乳动物样N-聚糖所需的酶系，用于生产表达哺乳动物糖蛋白的重组杆状病毒。PolyBac[9]是另一款经过改造的杆状病毒载体，支持多重转基因插入，已被成功应用于昆虫细胞糖基化途径的定制化改造。目前科研人员已开发出多款搭载不同N-聚糖酶的PolyBac衍生杆状病毒载体，这类载体既能表达目标蛋白，又能携带特定糖基化酶来实现预期的糖基化模式。

4. 重组杆状病毒生产

BEVS通常需要生成至少一种携带目标基因(GOI)的重组杆状病毒。尽管市面上已有多种重组杆状病毒生产系统，但大多数都基于两种策略之一。第一种策略是在昆虫细胞内进行同源重组：一种是将经过基因改造、能在大肠杆菌(杆状病毒)中复制的杆状病毒基因组(称为杆状病毒)，该基因组携带生成病毒所需的所有遗传信息，但可能因关键基因被截短而无法产生野生型病毒；另一种是将携带目标基因序列(GOI)的转移质粒插入昆虫或杆状病毒启动子下游。这种表达盒(包含启动子、 目标基因和转录终止信号)两侧带有两个区域，可与杆状病毒进行重组。当重组发生时，关键基因得以重建，使携带GOI的 杆状病毒恢复在昆虫细胞中的复制能力。牛津表达技术公司的flash BAC?平台正是采用这一方法。第二种策略则是通过Tn7转座子的位点特异性转位进入杆状病毒。市售的Bac-to-Bac表达系统(英杰公司)正是基于这种方法。简而言之，该系统包含以下组件：转移质粒载体

将GOI载体置于特异性启动子调控下，该启动子两侧带有Tn7转座位点，可使转座酶在大肠杆菌DH10Bac细胞内完成转座。这些细菌细胞同时携带杆状病毒质：透ㄖ柿，后者编码Tn7转座酶。完成细菌细胞内的转座后，需对杆状病毒质粒进行纯化处理，并将其转染至昆虫细胞中，最终获得重组杆状病毒。

对于需要携带一个以上目标基因的杆状病毒制备，目前已有现成的系统可供使用。Multi Bac [10]是一种改良型杆状病毒基因组，通过结合Cre介导的质粒融合技术，采用序 列重复扩增与无连接克隆的迭代循环，可实现多个目标基因的插入。近期，纽霍尔德团队[11]开发了基于黄金门技术的单步克隆系统GoldenBac，该系统兼容Tn7转座子和同源重组(HR)杆状病毒载体。与此类似，SmartBac[12]采用多蛋白构建策略，通过重叠PCR与 Gibson组装技术结合Cre-LoxP重组，成功制备出携带多个目标基因的大容量转移质粒。

值得注意的是，Jacob等人最近的一份报告[13]研究表明，与基于Tn7的系统相比，用于重组杆状病毒生产的HR系统稳定性更高，这表明HR系统可能更适用于安全生物制品的生产。此外，实验还被用于鉴定最小杆状病毒基因组，并改进表达载体的构建[14, 15]。

5. 杆状病毒衍生免疫原用于疫苗开发

一般来说，疫苗学中一个好的免疫原应该诱导一种反应，以完全预防或减少病原体感染。

免疫原能否产生良好的保护效果，很大程度上取决于其特性。像活体减毒病毒株和细菌这类模拟自然感染的疫苗通常能产生高效免疫，而由多糖制成的亚单位疫苗效果则相对较弱，可能需要更复杂的配方(如添加佐剂)配合使用，并且接种方案往往需要分多次注射并进行加强。因此，合理的免疫原设计至关重要，包括研究功能表位和关键蛋白质等。

BEVS系统的多功能性已被广泛用于生产大量和多种免疫原，用于人类和兽医用途。

5.1. 重组蛋白

在开发亚单位疫苗时，即不携带完整病原体而只携带部分病原体的疫苗，重组蛋白的生产通常是所选择的策略。

BEVS为异源蛋白生产提供了一个快速、灵活且成本低廉的平台，这在应对新冠疫情等全球卫生紧急事件时尤为重要。有研究指出，以流感疫苗为例，若采用BEVS替代传统胚胎化鸡蛋培养平台，原本需要六个月才能完成的4.25亿支疫苗生产周期，将缩短至45天即可完成。FluBlok?[17](Protein Sciences Corporation)是四价流感疫苗，通过BEVS生产，表达四种不同甲型和乙型流感病毒毒株的血凝素(HA)蛋白，目前已获得FDA许可用于18岁及以上人群。

在临床前研究阶段，Shin团队成功研发出针对寨卡病毒(ZI KV)[18]的重组疫苗候选株。该疫苗基于两种寨卡病毒毒株表达的杆状病毒包膜蛋白构建，其保护效果在妊娠小鼠及其子代中得到验证，证实母体抗体能够传递给胎儿。此外，研究团队还观察到交叉抗体介导的登革热病毒(DENV)中和作用。该系统生产的其他病毒抗原在临床前阶段也展现出良好的免疫原性，例如导致水貂难治性腹泻的水貂圆环病毒衣壳蛋白[19]、细小病毒VP2蛋白[20]，以及来自草饲动物的VP4和VP35蛋白。

例如鲤鱼轮状病毒(GCRV)[21]等。需要特别说明的是，上述蛋白质均以野生型形式表达，未进行任何人工修饰。

此外，研究人员还开发了携带目标抗原与另一种蛋白质的嵌合体。例如，李及其团队[22]在田间试验中首次证实：由水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)与口蹄疫病毒VP1 GH环表位组成的嵌合体疫苗，在免疫原性方面已超越市售疫苗。该疫苗通过生物等效性验证系统(BEVS)成功制备。

除了传统疫苗通过预防接种者患病来实现疾病防控外，科学家还研发出其他类型的疫苗。其中，疟疾传播阻断疫苗(TBVs)作为关键辅助手段，在加速消除疟疾方面发挥着重要作用。这类疫苗能诱导人体产生抗体，阻止疟原虫的有性繁殖阶段进入蚊子中肠，从而阻断人蚊传播链。近期，两项关于基于生物工程病毒载体(BEVS)生产的重组TBV候选疫苗的研究成果已正式发表。李等人[23]研究表明，Pfs48/45 6C蛋白片段在贝氏疟原虫(BEVS)中表达时无需融合伴侣即可发挥作用。通过抑制N-糖基化修饰，该蛋白仍保持生物活性并展现出显著的阻断传播效果。另一项由奎及其团队完成的研究显示，贝氏疟原虫中表达的间日疟原虫HAP2蛋白具有阻断传播活性，研究者首次将其列为新型TBV候选[24]。

针对白喉、破伤风等细菌性疾。呙绲难蟹⒅氐阍谟诎邢蜃饔糜谥虏《舅。类毒素疫苗属于严格意义上的亚单位疫苗，通常由化学灭活的毒素或经过灭活处理的重组毒素构成。以杆状病毒表达类毒素为例，其成功案例包括生产出无毒的产气荚膜梭菌[25]C末端CPA毒素。

自COVID-19大流行开始以来，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)免疫原的开发一直是许多制药公司、政府机构和研究实验室共同关注的焦点。尽管昆虫细胞生产的免疫原已处于研发后期，但首批在紧急使用授权下获批的疫苗仍采用其他生产系统。不过诺瓦瓦克斯公司研发的COVID-19疫苗(现以Nuvaxovid和Covovax品牌上市)成为首个获得FDA批准的生物等效疫苗(BEVS)，也是第五款获批的同类产品。该疫苗被生产商称为纳米颗粒疫苗，实则属于亚单位疫苗。其核心成分是经过改造的刺突蛋白，通过将脯氨酸取代原有残基(K986P和V987P)来维持糖蛋白的融合前构象，并增强其抗蛋白酶切割能力[26]。在Sf9细胞中生产的蛋白质被整合到细胞膜后，与M-Matrix佐剂共同组装成脂质纳米颗粒。数据显示，该疫苗采用两剂接种方案时总有效率达90.4%，对预防中重度疾病[26]的保护率更是高达100%。

5.2. 类病毒颗粒

在前一节中，美狮贵宾会讨论了亚单位免疫原。尽管它们比减毒活疫苗更安全，但往往需要更高剂量或加强剂才能激发有效免疫应答。病毒类免疫原的一个极具吸引力的替代方案是病毒样颗粒(VLPs)。这类自组装纳米结构既能模拟有包膜病毒粒子，也能模仿无包膜病毒的衣壳。其组成可包含单个或多个病毒蛋白，既有全长蛋白也有截短蛋白，既有野生型也有基因工程改造的版本。与病毒粒子不同，VLPs不具备复制能力——虽然可能含有部分遗传物质，但既无法自我复制，也不会恢复致病基因型。基于此类结构的疫苗融合了减毒病毒粒子和亚单位疫苗的优势：纳米级尺寸、自佐剂特性以及表位多拷贝分布的特点，都能被免疫系统精准识别并有效激活。

杆状病毒与昆虫细胞已被广泛用于病毒样颗粒(VLPs)的制备，采用多种技术手段。最基础的方法是用携带野生型免疫原的重组杆状病毒感染易感昆虫细胞，该免疫原可自组装形成VLPs。根据蛋白质特性不同，VLPs可通过两种途径获。喊ばVLPs直接从细胞膜出芽，可从上清液中提。灰驴切VLPs则需通过细胞裂解液获取。典型案例包括：源自HIV gp140(gp120及gp41胞外结构域)[27]、嵌合型诺如病毒VP1[28]与野生型诺如病毒VP1[29]、牛乳头瘤病毒9型(BPV9)L1 [30]、柯萨奇病毒B4 VP1[31]等VLPs。所有这些VLPs在临床前研究中均显示出良好的免疫原性。

更复杂的病毒样颗粒，即携带多种蛋白质的病毒样颗粒，也可以通过重组杆状病毒感染敏感细胞或幼虫来产生。针对这一设计方案，美狮贵宾会可选择两种替代方案：一是让多种杆状病毒共同感染宿主细胞，每种病毒仅携带一个外源蛋白基因；二是采用单一杆状病毒感染策略，通过不同启动子调控目标基因表达。采用后一种方法时，伯纳迪诺团队[32]成功制备出携带包膜蛋白(RVGP)和基质蛋白(RVM)的狂犬病病毒样颗粒。同理，张等人[33] 研究人员成功制备出含有VP1和VP3衣壳蛋白的柯萨奇病毒B5(CVB5)病毒样颗粒(VLPs)。这些VLPs不仅完美复刻了CVB5病毒粒子的外形与尺寸，其引发的免疫反应也更为显著——通过检测总IgG水平和中和抗体水平发现，相较于灭活疫苗在小鼠感染致病性CVB5毒株时产生的保护效果，这种新型疫苗能激发更强的免疫应答。

虽然联合感染策略能够产生复杂的VLP，但需要优化感染倍数(MOI)，以确定最佳组合，从而将目标抗原以适当的化学计量结合到VLP中，这并不总是直接的。不过，当只需要一种重组杆状病毒时，某些多蛋白病毒样颗粒(VLPs)的制备会更加便捷。例如，源自编码可自我切割多蛋白的病毒的VLPs就属于这种情况。目前这类多蛋白VLPs已在昆虫细胞中成功制备，包括登革热病毒[34]和肠道病毒71 [35]等多种病毒株。

这两种策略的缺点在于，病毒样颗粒(VLPs)需要从已出芽的杆状病毒(BVs)中进行纯化分离。虽然BVs本身可作为佐剂促进T细胞CD8 +免疫应答，但树突状细胞成熟后会分泌促炎性细胞因子[36, 37]。由于部分制剂需避免这些成分的存在，这就需要额外增加纯化步骤。

作为感染介导策略的替代方案，可开发稳定转化的重组昆虫细胞系。目前市面上已有现成载体可供使用，例如pIB/V5-His及其变体(赛默飞世尔科技公司)，当然也可以自行构建载体。这种替代方案不含BV病毒，且便于纯化——这对于包膜病毒样颗粒(VLPs)而言尤为重要。例如，Khanefard及其同事[38]成功地生成了一种转基因Sf9细胞系，该细胞系以组成性方式产生H5N1流感神经氨酸酶VLPs，并具有免疫原性。

市售的病毒样颗粒(VLP)疫苗已问世多年(首个重组蛋白乙肝疫苗于1986年获批)[39]，但唯一采用昆虫细胞生产并获准用于人体的疫苗仍是葛兰素史克公司的Cervarix?。该疫苗可预防多种人乳头瘤病毒(包括HPV16和HPV18)，其核心成分是源自HPV16型和18型L1蛋白——这两种病毒类型导致了全球70%的宫颈癌病例。新一代基于VLP的HPV疫苗通过同时表达L1和L2蛋白或L1-L2嵌合体，展现出更广谱的保护效力。目前针对其他病原体的多款VLP疫苗已进入临床试验的高级阶段。值得一提的是，基于VLP技术的抗SARS-CoV-2疫苗也正处于不同研发阶段[43]。

虽然VLPs是一个非常有吸引力的平台，用于生产新一代免疫原，因为它们结合了灭活疫苗和亚单位疫苗的优点，

由于通常需要对VLP进行杂质共纯化，因此纯化过程可能比较繁琐，这增加了下游处理成本。

5.3. 杆状病毒表面和衣壳显示

在病毒表面展示感兴趣的蛋白质有多种应用，从确定蛋白质相互作用到诊断工具以及免疫原。

杆状病毒作为展示载体很有趣，因为与其他病毒载体不同，在人类和其他脊椎动物中没有预先存在的免疫力。

在病毒出芽表面展示目标蛋白的技术(即表面展示技术)可通过多种策略实现，这些策略涉及将目标蛋白或特定肽段与GP64蛋白及其部分结构进行嵌合融合。当蛋白质与完整GP64融合时，会形成兼具膜运输信号、成熟过程及整合到出芽病毒所需全部功能的嵌合蛋白。通过该技术，科学家已成功展示出HIV-[44]的GP120和弓形虫[45]的ROP4等大型蛋白。

另一种可能的组合方式是将蛋白质与GP64的信号肽(SP)、跨膜区(TM)及胞质结构域(CTD)融合，其中GP64的胞外结构域被目标蛋白替代。例如，薛教授团队成功展示了水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E[46]，该展示在小鼠体内引发了强烈的免疫反应。此外，猪圆环病毒2型(PCV2)Cap(d41)蛋白的展示在小鼠和猪体内均能诱导免疫应答[47]。采用相同策略，罗教授团队[48]构建了寨卡病毒(ZIKV)E蛋白的嵌合体，该蛋白通过脂质体表面展示，在小鼠模型中展现出对寨卡病毒的保护作用。尽管目前更常见的是将膜蛋白胞外结构域与GP64的跨膜区融合展示，但也可保留目标蛋白的野生型跨膜区，同时将其与GP64的信号肽和胞质结构域进行双重融合。

然而，在某些情况下，该蛋白可以不与GP64融合而被整合到包膜中，如流感病毒的血凝素(HA)[49]或水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白[50, 51]。

需要强调的是，重组杆状病毒仍保留GP64的野生型拷贝，该拷贝将与嵌合体一起整合到包膜中。

虽然杆状病毒表面展示技术能够引发体液免疫应答，但其诱导T细胞CD8+型细胞应答的效果并不理想[52, 53]——这类免疫反应对清除胞内病原体至关重要。不过，出芽病毒在另一种抗原展示方式(衣壳展示)中却能大显身手。由于翻译后的蛋白质经过加工处理后可通过MHC-I途径呈递，这种展示方式更有利于激发此类免疫应答。

衣壳展示技术利用杆状病毒能够侵入多种不同细胞的特性，其核心在于将目标蛋白整合到病毒衣壳中。该原理与表面展示类似，具体过程是将目标蛋白或肽段与主要衣壳蛋白VP39 [54]融合。

结果表明，将OVA(卵清蛋白)与VP39融合后，专业呈递细胞可呈现抗原MHC-I，并诱导细胞毒性免疫应答[52, 55]，且该策略显著降低了引发强烈免疫应答所需的抗原量。

6. 杆状病毒进入哺乳动物细胞：转导

如前所述，尽管AcMNPV病毒无法在脊椎动物体内复制，但它能够进入哺乳动物细胞，并通过哺乳动物启动子表达异源基因，这一过程被称为基因转导。杆状病毒的转导能力已被用于诱导特异性免疫应答[56]，近年来更被应用于开发多种基因治疗策略。然而，AcMNPV病毒进入哺乳动物细胞的具体机制仍不明确。最初有研究认为其通过静电作用实现入侵。

病毒与细胞膜的相互作用在病毒入侵过程中起着关键作用[57]。研究表明，杆状病毒通过与细胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(尤其是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)结合，实现对哺乳动物细胞的感染和转导[58]。基于GP64糖蛋白介导的膜融合机制及杆状病毒进入昆虫细胞的途径，研究者提出：在哺乳动物细胞中，依赖网格蛋白介导的内吞作用(不依赖低pH环境)是主要入侵机制。此外，观察发现病毒在早期内体中的融合过程，可能是影响高效转导的主要障碍[59]。值得注意的是，有报道称小窝结构可能参与杆状病毒的入侵——在BHK21细胞系中，使用干扰小窝体形成的抑制剂染料木黄酮时，转导效率显著提升[60]。另一方面，一些结果表明，杆状病毒可以通过不同于网格蛋白介导的内吞作用或巨胞饮作用的机制进入某些哺乳动物细胞系，如肝细胞，这表明吞噬作用也可能参与其中[61]。

尽管AcMNPV的病毒进入机制似乎存在细胞类型依赖性差异且需进一步研究，但GP64糖蛋白在介导病毒入侵中的关键作用已十分明确[62]。GP64对杆状病毒侵入哺乳动物和昆虫细胞时的病毒附着、内化及内体膜融合过程至关重要[63]。AcMNPV的附着始于GP64与细胞表面分子的相互作用，随后内体内部的pH值变化会触发该糖蛋白的构象改变。病毒进入细胞后，会被转运至内体，核衣壳释放到细胞质中，并通过肌动蛋白驱动的运动机制被立即引导至细胞核，从而实现核孔复合体的跨膜转运[64]。在细胞核中，病毒DNA被宿主机制识别和转录；在此阶段观察到细胞染色质分布的改变[65]。

提高杆状病毒转导效率的策略

尽管杆状病毒能够进入多种类型的细胞，但这一过程并不总是高效。近年来，研究人员开发了多种策略来提高杆状病毒的转导效率。其中一些方法涉及使用聚乙烯亚胺(PEI)或聚乙二醇(PEG)[66, 67]等化学试剂，通过修饰病毒与细胞膜之间的静电相互作用。另一种方法是利用其他病毒的融合蛋白对杆状病毒进行假型化改造。此外，有报道称，使用水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白进行假型化的病毒，其转导哺乳动物细胞的效率比未进行 假型化的病毒更高(图2B)。有趣的是，在低转导复数条件下使用截短版VSV-G而非全长版本时，转导效率并未得到提升[68]。此外，其他蛋白质也被用于杆状病毒的假型，包括甲型流感病毒神经氨酸酶[69]或Thogotovirus[70]的糖蛋白。

VSV-G病毒还被融合到杆状病毒表面的肿瘤配体(LyP-1、F3和CGKRK)上，使肿瘤结合能力和特异性转基因表达效率提升了2至5倍[71]。另一种提高转导效率的策略是开发携带亲和素的杆状病毒。这种表面修饰显著增加了病毒进入细胞的能力，从而大幅提升了基因递送效果[72]。不过，提升转导效率的手段不仅限于病毒蛋白。研究团队还在杆状病毒包膜中添加了三种疟疾环孢子虫蛋白变体，成功增强了其在肝细胞中的转导效率[73]。但需要指出的是，转导效率不仅取决于病毒进入细胞的能力，更与基因表达的整体水平密切相关。为提高杆状病毒转导效率，研究人员采取了一种通过抑制抗病毒反应相关基因来增强基因表达的策略。王等人报告称，敲低受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)——该蛋白在免疫应答和细胞死亡调控中起重要作用——可导致不同人类细胞系中杆状病毒介导的转基因表达增加(图2D)，且不影响细胞活力或病毒进入[74]。

图2.通过使用产生复制性附加体的载体(A)、表面展示GP64或VSV-G嵌合体的多拷贝版本(B)、补体抑制剂表面展示(C)以及靶向抗病毒应答通路的shRNA表达(D)来提高转导效率。改编自BioRender.com所著《病毒入侵者检测》和《补体通路》(访问日期：2022年11月29日)。数据来源于https://app.biorender.com/biorender-templates.

7. 基因疗法

基因疗法是一套具有高度灵活性的治疗策略，因其能根据个体差异进行个性化调整，可应用于包括癌症在内的多种疾病治疗。基因治疗载体主要分为两大类：非病毒型和病毒型。

载体。非病毒载体主要由共轭多阳离子聚合物构成，这类物质能够实现DNA的递送。带正电荷的脂质体就是这类载体的典型代表。虽然这类载体在生物安全方面具有优势，但其应用受限于转基因递送和表达效率较低[75]。另一方面，病毒载体如杆状病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒及腺相关病毒(AAV)等，在细胞进入和转导不同基因时效率更高。具体优缺点取决于不同病毒载体的特性[76]。目前，AAV载体、慢病毒和逆转录病毒已成功应用于临床，共有19种获得FDA批准的基因治疗产品[77]。

然而，慢病毒和逆转录病毒载体的克隆能力较低，并且有可能因整合到宿主基因组中而发生突变。此外，在开发具有复制能力的逆转录病毒时还存在潜在的安全性问题[78]。当前病毒载体的高生产成本、低可扩展性和潜在的生物安全问题突显了使用杆状病毒进行基因治疗的巨大潜力[79, 80]。

杆状病毒基因递送系统凭借其多功能性和低毒性，不仅能够实现精准给药，还能设计克隆大型复杂治疗性基因，有效降低副作用并提升疗效[81]。该基因治疗系统易于改良，有望成为靶向基因治疗的重要工具。杆状病毒(BV表型)已在癌症治疗、疫苗研发和再生医学等多个领域成功应用，充分展现了其广泛适用性[81-84]。

与其他常见病毒载体相比，杆状病毒具有多项优势。首先，杆状病毒介导的转导不会对哺乳动物细胞产生毒性作用，即使在高MOI [85, 86]条件下也不会干扰细胞生长。此外，杆状病毒不会在被转导的哺乳动物细胞中复制[79]。杆状病毒的这些特征尤为重要，因为其他病毒载体是人类病原体或整合到宿主基因组中，因此具有生物学风险。

杆状病毒作为基因治疗载体的另一大优势在于其强大的克隆能力。杆状病毒(Ac-MNPV)基因组是一个130 kb的环状双链DNA分子，最大克隆容量至少可达38 kb。相较于逆转录病毒和AAV载体[87]的有限克隆能力，这种灵活性显得尤为突出。

与其他病毒载体相比，杆状病毒的生产更为便捷。逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒(AAV)载体需要将携带必需基因的质粒转染至包装细胞才能完成生产。而杆状病毒则不同，只需通过悬浮培养或单层培养感染昆虫细胞，感染后3-4天即可收集上清液进行扩增。更值得一提的是，从构建、扩增到操作的整个流程，完全可以在生物安全等级1(BSL-1)实验室中完成，无需任何特殊设备。但是，根据基因组中所含转基因的性质，可能需要高于BSL-2的生物安全等级。

最后，一个最重要的优势在于哺乳动物对杆状病毒不存在先天免疫。相比之下，其他病毒载体最常见的问题之一是：大多数人一生中都会接触这些病毒并产生特异性体液免疫应答。此时，体内循环的抗体会显著降低病毒载体转导效率[87]。

然而，杆状病毒作为基因治疗载体也存在明显缺陷。其主要缺点在于只能在哺乳动物细胞中诱导短暂的转基因表达。在体内环境中，转基因表达水平通常会在第7天开始下降，并于第14至21天[81, 88]完全消失。此外，与逆转录病毒、慢病毒及腺相关病毒(AAV)载体相比，使用杆状病毒进行体外转基因表达的持续时间显著缩短。

杆状病毒载体与其他病毒载体的不同之处在于，其携带的基因在宿主细胞核中可以持续存在的时间。逆转录病毒、慢病毒和腺病毒载体的DNA可以以整合或游离的形式在细胞核中长期存在。

相比之下，Tjia等人证明杆状病毒DNA在转导哺乳动物细胞的细胞核中仅存留24-48小时[76]。

使用杆状病毒作为基因治疗载体的另一个缺点是补体介导的灭活效应。当杆状病毒与血清补体接触时，会迅速导致病毒失活。为减少补体对杆状病毒转导的负面影响，需要进行多项改良。但需注意的是，补体系统并非杆状病毒独有的难题——它同样构成了脂质体、小鼠逆转录病毒及各类合成DNA复合物[87, 89]等其他基因递送系统的体内应用障碍。

此外，杆状病毒与其他包膜病毒类似，具有极强的脆弱性。其包膜结构对病毒的感染能力和转导能力至关重要——这主要归功于锚定在包膜上的GP64蛋白，该蛋白负责促进病毒与细胞膜的融合[90]。正因如此，病毒极易受到机械剪切力的影响，导致稳定性相对较低。这种普遍存在的问题在其他包膜病毒中同样存在，例如逆转录病毒。超速离心法常用于杆状病毒的纯化，但也会导致感染性显著降低，这可能是由于病毒包膜受损所致。其热稳定性较差，加上存在被血清补体灭活的风险，可能进一步限制杆状病毒基因传递载体[76, 91]在体内的应用。

7.1. 杆状病毒基因传递载体

随着杆状病毒转导哺乳动物细胞能力的发现，其治疗应用迅速扩展。此后，研究人员对病毒基因组进行改造和调控，以提高转导效率并简化生产流程。由此开发出多种载体系统，包括BacMam、Bac-to-Bac、Multi Bac以及这些AcMNPV转移载体的衍生物[92-95]。

要使外源基因正确表达，必须选择病毒或哺乳动物启动子，并被转导细胞的转录机制所识别。由于病毒p10和多角体蛋白启动子具有较高的表达活性，因此在昆虫细胞中被最频繁地用于促进转录。然而，哺乳动物启动子也可用于病毒转导后驱动异质性基因表达。这类系统通常称为BacMam[93]。

BacMam系统中使用的某些哺乳动物启动子包括巨细胞病毒(CMV)、猴病毒40(SV40)、鸡β-肌动蛋白(CAG)和乙肝病毒(HBV)等基因启动子[96]。

病毒和哺乳动物启动子可以与基因组增强子结合，以促进转基因的转录。具体来说，将额外的同源区域1(hr1)插入杆状病毒中已被用于激活哺乳动物启动子，并提高了转基因的稳定性，延长了转基因的过表达时间[97]。

启动子的选择还需根据目标基因的特性(蛋白质、长链非编码RNA、短发夹RNA、基因调控RNA)来确定。本文将重点解析杆状病毒载体的设计原理，具体分析不同治疗基因(GOI)的特性如何影响载体设计，并着重探讨在个性化治疗中优化其应用的多种策略。

7.2. 蛋白质表达

目前应用最广泛的杆状病毒基因治疗策略是表达一种或多种具有特定生物学活性的蛋白质，这种生物学功能可作为治疗一种或多种疾病的效应因子。

在基因治疗的众多靶向疾病中，癌症是最受关注的领域之一。以杆状病毒为基础的抗癌蛋白表达技术为例：鸡传染性贫血病毒凋亡素可对抗肝癌[98]；单纯疱疹病毒胸苷激酶能抑制胶质母细胞瘤[99]；抗血管生成融合蛋白则用于治疗前列腺癌和卵巢癌[100]；此外还有CD40配体等其他应用。

膀胱肿瘤中的IL-15[101]和下咽癌中的碘化钠同向转运体表达[102, 103]。

基于杆状病毒的蛋白质表达技术也被应用于其他疾病的治疗，例如肝性脑病[104]和心血管疾病[105-112]。此外，该策略还被用于再生医学和组织工程学[113-118]。

7.3. shRNA和ncRNA表达

除了蛋白质的表达，另一种治疗策略是表达具有预期生物学功能的非编码RNA。

通过杆状病毒转导不同细胞系并表达shRNA(短发夹RNA)，可有效抑制目标mRNA [119]的表达。此外，该技术还可用于介导RNA干扰(RNAi)。研究显示，编码 RNAi序列的重组杆状病毒在体外培养细胞中使靶基因表达量降低95%，在大鼠脑组织活体实验中则达到82%的抑制效果[87, 120]。

最近，Gottardo和Pidre等人通过shRNA表达开发了一种靶向线粒体肽Humanin及其大鼠同源物Rattin的重组杆状病毒。敲低Humanin表达可诱导体外和体内垂体肿瘤细胞，并在小鼠模型中显著抑制肿瘤进展[121]。同一recBV在卵巢癌细胞中也表现出类似效果[122]。

此外，Chen等人构建了含有睡眠美人转座子的杆状病毒杂交系统，该转座子表达长链非编码RNA(LncRNA)PTENP1，用于治疗小鼠模型中的肝细胞癌[123]。

李等人提出了一种创新策略，开发出双杆状病毒系统：其中一种病毒携带由loxP位点包围的miR-214靶序列，另一种则编码Cre重组酶。通过在脂肪源性干细胞(ASC)中进行共转导，成功培育出miR-124海绵。实验结果显示，miR-214水平显著降低，ASC细胞的骨再生能力得到[124, 125]倍提升。

7.4. CRISPR/Cas系统

随着CRISPR/Cas技术的出现，杆状病毒递送系统得到了升级，不仅可以用于基因编辑，还可以用于表观遗传调控和RNA靶向。

欣德里克森等人研究人员开发了一种基于Tn7转座子的重组系统，该系统通过携带sgRNA和sgCas9的转移载体实现基因编辑。实验表明，这种重组杆状病毒能在多种哺乳动物细胞中精准编辑目标基因[126]。近期，奥利西诺团队对基于DNA组装技术的Mult-iMate系统进行优化升级，不仅简化了载体构建流程，还优化了杆状病毒(BV)的生产效率，并成功实现了不依赖同源序列的靶向整合(HITI)，在spCas9酶激活后完成精准基因插入[127]。

关于疾病基因治疗，使用杆状病毒传递的CRISPR/Cas系统在动物模型中治疗神经损伤[128]和调节血清胆固醇水平[129]。

另一方面，这些类型的工具已被用于昆虫系统中，以高效编辑鳞翅目昆虫的基因组[130]以及编辑杆状病毒的基因组，以提高其生物杀虫剂的能力[131]。

7.5.在BEVS中生产的recAAV

AAV是一种小型无包膜二十面体负链单股DNA病毒(细小病毒科)。由于其结构简单、具有细胞趋向性，且能长期转导表达转基因的非分裂细胞，基于AAV的病毒载体已被广泛应用于基因治疗[132-134]。最初，重组腺相关病毒(rAAV)的制备方法是通过将携带治疗序列和干扰序列(ITRs)的质粒，以及含有AAV基因和其他病毒(通常是腺病毒基因)必要片段的辅助质粒转染至哺乳动物细胞系。然而这种方法无法达到人类治疗所需的产量[135]。这些局限性促使研究者开始评估重组腺相关病毒的生产效率。

补体系统[136]。BEVS正是通过这种方式实现的。首先，美狮贵宾会采用了三种重组杆状病毒(两种独立杆状病毒携带rep和cap基因，第三种则使用ITR-GOIITR构建体：即所谓的ThreeBac系统，Glybera?)[137]。随后，美狮贵宾会进行了多项优化改进，包括减少重组杆状病毒的数量[138-141]。所有这些贡献使杆状病毒-昆虫细胞生产平台成为AAV基因治疗产业的理想替代方案。

8. 提高杆状病毒在基因传递中的转导效率

杆状病毒转导效率受多种因素影响，包括细胞类型、包膜糖蛋白、细胞染色质状态及启动子类型等。鉴于美狮贵宾会已讨论过提升病毒进入的策略，接下来将重点探讨异源构建设计中其他有助于改善和增强转基因表达稳定性的关键要素。

8.1. 启动子选择

杆状病毒基因传递系统中使用的启动子可决定基因治疗中转导的效率。在昆虫细胞表达系统中最常用的病毒启动子包括多角体蛋白和p10。若将异源蛋白的编码序列与gp64蛋白N端区域的对应序列融合，即可将其整合到病毒包膜中并递送至靶细胞。其他常用的病毒启动子包括p6.9、病毒vp39启动子以及即刻早期基因(IE1)启动子，这些启动子在病毒早期阶段[142, 143]具有较高的表达水平。

然而，若要让治疗性基因在哺乳动物细胞中成功表达，就必须选择能被细胞转录机制精准识别的启动子。为此，研究人员已将人类巨细胞病毒、泛素C、磷酸甘油酸激酶以及延伸因子-1α(EF1α)的不同启动子整合到各类杆状病毒载体系统中[144]。启动子的转录效率很大程度上取决于细胞类型及其生理状态。此外，通过将启动子与转录增强子结合使用，可显著提升转基因的表达水平[145]。值得注意的是，启动子的表达步骤本身也会对基因表达产生影响。病毒和哺乳动物启动子的多种组合使杆状病毒基因传递系统成为一种具有极高通用性和定制能力的替代方案[81, 96]。

8.2. 杆状病毒GOI在体内和体外的表达扩展

如前所述，尽管重组杆状病毒具有诸多优势，但其体内转基因表达窗口期相对较短，最长仅21天[146]。这可能是因为杆状病毒会同时激活经典途径和补体替代途径，导致病毒失活[147]。为防止补体激活并延长基因表达，研究者已采用多种方法。通过在病毒包膜表面表达衰变加速因子(DAF)、类H因子1蛋白及C4结合蛋白等物质，可有效阻断这两种补体通路的激活[148, 149]。河合等人发现，将CD46和CD59蛋白与DAF融合后，病毒颗粒能获得抗补体保护(图2C)[150]。通过上述方法抑制补体激活，可显著延长体内基因表达时间。虽然短时间的基因表达对伤口修复是有用的，但其他类型的治疗，如癌症治疗可能需要更长时间的基因表达。

在杆状病毒包膜中添加GP64以外的其他糖蛋白可以延长体内表达的时间窗口。将水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白插入后，DBA/2J小鼠的基因表达时间延长至178天，BALC/c小鼠则为35天[151, 152]。

Sung等人证明，通过两种不同的杆状病毒载体(一种编码重组酶，另一种编码目标基因两侧由重组酶特异性重组位点所包围)的非复制表达外显子，在两种载体种均会增加，与转基因表达持续时间[153]相同。

此外，研究团队采用相同策略构建了可维持长达48天[154]的复制性游离体。该策略的核心在于：通过一个载体编码Cre重组酶，该酶会切割另一个载体的部分基因组，从而形成包含治疗基因、oriP复制起点序列以及EBV EBNA1蛋白编码序列的游离体。这种游离体能够识别该复制起点并促进病毒复制(图2A)[153-155]。

9. 结束语

杆状病毒，尤其是AcMNPV，在多种生物技术应用领域已得到广泛研究和应用多年。这些基于杆状病毒的新技术开发工作，不仅在农业领域，还在动物和人类健康等多个领域产生了不同产品和概念验证[81, 96, 134]。

通过基因工程技术改造AcMNPV病毒以生成改良型病毒颗粒，这一方法已在基础研究和应用领域得到广泛应用。最初的研究基于昆虫细胞培养中的同源重组技术，但随着AcMNPV杆状病毒载体的问世，细菌基因组修饰技术也得以实现[96]。此外，针对Ac-MNPV基因改造还开发了创新策略，包括构建人工合成基因组[156, 157]以及运用CRISPR/Cas技术进行基因编辑[127, 131]。

由于杆状病毒的多功能性，它们不仅可以作为生物杀虫剂使用，还可以作为重组蛋白和纳米结构(如VLPs)表达的载体，用于生成蛋白质展示平台，并作为基因传递载体转导哺乳动物细胞[134]。首批通过BEVS技术开发并投入市场的商业产品包括：针对人类健康的Cervarix?(人源病毒样颗粒疫苗，葛兰素史克公司，2007年)；用于前列腺癌免疫治疗的Provenge?重组蛋白(丹德龙公司，2010年)；抗流感的人源亚单位疫苗Flublok?(蛋白质科学公司，2013年)；以及基于BEVS生产的recAAV载体开发的脂蛋白脂肪酶缺 乏症基因治疗产品Glybera?([134, 158])。另一方面，BEVS生产的多款兽用产品已上市(见表1)。在COVID-19领域，诺瓦瓦克斯公司(Novavax Inc.)推出的Nuvaxovid和Covovax疫苗，是首款获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准的BEVS新冠疫苗[159]。

表1.基于BEVS的健康相关产品一览表。

A 相同的产品 ，但根据地理区域的不同而以不同的名称获得许可。

近年来，多种基于病毒的产品已获准用于人类临床，既包括基因治疗领域，也涵盖疫苗制剂[160]。与此同时，杆状病毒的基础研究与应用研究呈现爆发式增长，不仅深化了学界认知，更为病毒改造与应用提供了更优策略。 因此可以预见，在未来几年内，各类基于杆状病毒的技术很可能突破临床试验阶段，正式进入商业化进程。

杆状病毒的广泛用途及其无可争议的实用性，使其成为人类和动物健康的强大工具。从农业到制药行业的多个应用领域意味着，“魔杖”不再只是一个文字游戏，而是对其巨大技术潜力的真实引用，这得益于病毒粒子的独特形状。